Co dzieje się z Państwa próbkami w testDNA Laboratorium Sp. z o.o.?

W momen­cie kiedy Państ­wa prób­ki zosta­ją dostar­c­zone do lab­o­ra­to­ri­um są ewidencjonowane. Co to oznacza? Państ­wa zlece­nie otrzy­mu­je unika­towy numer, a każdej próbce nadawany jest indy­wid­u­al­ny numer (tzw. sam­ple ID). Przy admin­istrowa­niu zlece­ni­a­mi korzys­tamy ze spec­jal­nego, zwali­d­owanego opro­gramowa­nia, które zabez­piecza przed nadaniem tego samego numeru prób­ki czy zlece­nia a tym samym wyk­lucza możli­wość zami­any próbek między zlece­ni­a­mi. Przestrze­ganie określonych pro­ce­dur to dla lab­o­ra­to­ri­um codzi­en­ny obow­iązek. Jed­nym z nich jest kon­tro­la pra­cy przez drugiego pra­cown­i­ka, który asys­tu­je pod­czas kluc­zowych etapów bada­nia, a także odpowia­da za praw­idłową real­iza­cję zlece­nia.

Jakie etapy przechodzą próbki w laboratorium?

.

Izo­lac­ja DNA
Wymazów­ki lub inne niety­powe mate­ri­ały w pier­wszej kole­jnoś­ci zosta­ją pod­dane pro­ce­sowi, który narusza ściany komórkowe i dzię­ki temu uzyski­wane jest DNA w czys­tej postaci. Na tym etapie wyko­rzysty­wane są odpowied­nie odczyn­ni­ki, inkubac­je próbek w wyższej tem­per­aturze oraz odwirowanie.

.

Ampli­fikac­ja DNA (reakc­ja PCR)
Ten dru­gi etap służy uzyska­niu więk­szej iloś­ci DNA, ponieważ ilość DNA otrzy­mana po etapie izo­lacji jest niewystar­cza­ją­ca do dal­szych anal­iz. Reakc­ja PCR to kopi­ar­ka DNA – niewielką ilość DNA moż­na zwielokrot­nić do poziomu potrzeb­ne­go w bada­niu. W trak­cie reakcji wyko­rzysty­wana jest zdol­ność rozłącza­nia się dwu­ni­ciowej helisy do poje­dynczych nici DNA, do których przyłącza­ją się odpowied­nie startery i enzymy, które odbu­dowu­ją nić. Reakcję tę przeprowadza się w urządze­niu nazy­wanym ter­mo­cyk­lerem. Niem­niej przed umieszcze­niem próbek w ter­mo­cyk­lerze przy­go­towu­je się je w odpowied­nich komorach lam­i­narnych, które zapo­b­ie­ga­ją kon­t­a­m­i­nacji czyli zanieczyszcze­niu. Do Two­jego DNA doda­je się mix spec­jal­nych odczyn­ników, który zaw­iera m.in. znakowane startery (primery), wolne nuk­leo­ty­dy, enzym polimer­aza oraz bufor wspo­ma­ga­ją­cy cały pro­ces. Aby dwu­ni­ciowa helisa mogła się rozdzielić do poje­dynczych nici pod­wyższa się tem­per­aturę w ter­mo­cyk­lerze do tem­per­atu­ry 96oC. Jest to tzw. denat­u­rac­ja DNA. Przy niższej tem­per­aturze 59oC do jed­non­i­ciowego DNA przyłącza­ją się startery, które początku­ją odbu­dowanie nici. Odbu­dowanie nici czyli jej wydłużanie (elon­gac­ja) zachodzi w tem­per­aturze 72oC i jest możli­wie dzię­ki enzy­mowi polimer­a­zie, która poma­ga połączyć się wol­nym nuk­leo­ty­dom dostęp­nym w przy­go­towanej wcześniej mieszaninie reak­cyjnej.

Taki cykl pow­tarzany jest w ter­mo­cyk­lerze ok. 30 razy.

Reakc­ja PCR jest bard­zo wrażli­wym pro­ce­sem. Istot­ny jest dobór odpowied­nich tem­per­atur, odczyn­ników, sprawność tech­nicz­na samego ter­mo­cyk­lera, a także jakość prób­ki. Walidu­jąc czyli potwierdza­jąc gotowość pro­ce­dury badaw­czej do wyko­rzys­ta­nia jej do badań ojcost­wa lab­o­ra­to­ri­um dokład­nie przetestowało warun­ki reakcji, sprawność dzi­ała­nia ter­mo­cyk­lera w stop­niu gwaran­tu­ją­cym Państ­wu praw­idłowy jej prze­bieg.

.

Rozdzi­ał elek­tro­fore­ty­czny DNA
Ten etap bada­nia jest możli­wy do real­iza­cji w urządzeni­ach potocznie nazy­wanych sek­we­na­tora­mi. W cza­sie elek­tro­forezy cząstecz­ki DNA obdar­zone ładunkiem ujem­nym wędru­ją w kierunku elek­trody o prze­ci­wnym znaku. Frag­men­ty o różnym ksz­tał­cie i wielkoś­ci migru­ją z różną pręd­koś­cią (zasa­da jest taka, że mniejsze frag­men­ty DNA migru­ją szy­b­ciej wzdłuż kapi­lary). W pewnym momen­cie następu­je detekc­ja frag­men­tów DNA przy wyko­rzys­ta­niu lasera zamon­towanego w sek­we­na­torze. Detekc­ja jest możli­wa m.in. dzię­ki temu, że do Państ­wa prób­ki na etapie ampli­fikacji dodano znakowane primery, które w rozdziale elek­tro­fore­ty­cznego potocznie określa­jąc świecą. Na tym etapie lab­o­ra­to­ri­um jest w stanie ocenić jakość Państ­wa prób­ki.
Dane z rozdzi­ału elek­tro­fore­ty­cznego anal­i­zowane są następ­nie przez spec­jalne opro­gramowanie Gen­emap­per, które pozwala na odczy­tanie wartoś­ci alleli w poszczegól­nych mark­er­ach. Na etapie obrób­ki danych w Gen­emap­perze widoczny jest już Państ­wa kom­plet­ny pro­fil gene­ty­czny.

.

Anal­iza statysty­cz­na
Dane po rozdziale elek­tro­fore­ty­cznym są wyko­rzysty­wane do obliczenia praw­dopodobieńst­wa ojcost­wa w danym przy­pad­ku. Jest to bard­zo istot­ny etap bada­nia ponieważ pozwala ustal­ić czy praw­dopodobieńst­wo ojcost­wa jest na tyle wysok­ie, że moż­na wydawać wynik graniczą­cy z pewnoś­cią. Według zale­ceń Pol­skiego Towarzyst­wa Medy­cyny Sądowej i Krymi­nologii wiary­godne wyni­ki potwierdza­jące ojcost­wo powin­ny mieć ustalone praw­dopodobieńst­wo na poziomie co najm­niej 99,9999%. W sytu­acji kiedy praw­dopodobieńst­wo jest mniejsze niż 99,9999% wów­czas zale­ca się zwyk­le włącze­nie do bada­nia mat­ki lub zwięk­sze­nie iloś­ci badanych mark­erów. W testD­NA lab­o­ra­to­ri­um Sp.z o.o. wyko­rzys­tu­je się anal­izę aż 24 mark­erów gene­ty­cznych stąd prak­ty­cznie w każdym przy­pad­ku uzyski­wane jest praw­dopodobieńst­wo co najm­niej 99,9999% nawet wtedy kiedy badamy tylko ojca i dziecko. Jeśli w bada­niu dany mężczyz­na został wyk­luc­zony jako bio­log­iczny ojciec wów­czas lab­o­ra­to­ri­um ma obow­iązek powtórzyć badanie od początku na pod­staw­ie nowej prób­ki a anal­iza jest prowad­zona przez innego pra­cown­i­ka.

.

Wys­taw­ie­nie wyniku bada­nia
W tym przy­pad­ku lab­o­ra­to­ri­um również korzys­ta z autorskiego opro­gramowa­nia, które automaty­cznie generu­je raport zmniejsza­jąc zde­cy­dowanie ryzyko wys­tąpi­enia błę­du ludzkiego. Raport zawsze jest opra­cowywany i auto­ry­zowany przez 2 oso­by. Auto­ryza­cji wyników mogą dokony­wać tylko pra­cown­i­cy posi­ada­ją­cy odpowied­nie upoważnie­nie.